Tom 8 • Numer 1 (Suplement 1) • Czerwiec 2021

KOMITET REDAKCYJNY

Redaktor naczelny:

dr hab. n. med. Małgorzata Piasecka, Szczecin
Zastępca redaktora naczelnego:
prof. dr hab. n. med. Jolanta Słowikowska-Hilczer, Łódź
Redaktor pomocniczy:
dr n. med. Kamil Gill, Szczecin
Sekretarz redakcji:
dr hab. n. med. Agnieszka Kolasa-Wołosiuk, Szczecin
Skarbnik redakcji:
prof. dr hab. n. med. Artur Wdowiak, Lublin
Członkowie komitetu redakcyjnego:
dr n. med. Szymon Bakalczuk, Lublin
dr n. med. Leszek Bergier, Kraków
prof. dr hab. n. biol. Barbara Bilińska, Kraków
prof. dr hab. n. med. Barbara Darewicz, Białystok
Prof., MD, PhD Aleksander Giwercman, Malmö, Sweden
PhD Yvonne Lundberg Giwercman, Malmö, Sweden
Prof., PhD (UPE/NMMU) and PhD (US) Gerhard Van der Horst, Republika Południowej Afryki
(Bellville, Republic of South Africa)
prof. dr hab. n. med. Grzegorz Jakiel, Warszawa
prof. dr hab. n. med. Piotr Jędrzejczak, Poznań
prof. dr hab. n. med. Małgorzata Kotwicka, Poznań
dr hab. n. med., prof. UMK Roman Kotzbach, Bydgoszcz
prof. dr hab. n. med. Krzysztof Kula, Łódź
prof. dr hab. n. med. Maria Laszczyńska, Szczecin
dr hab. n. med., prof. UMK Grzegorz Ludwikowski, Bydgoszcz
prof. dr hab. n. med. Marek Mędraś, Wrocław
MD, PhD, DMSc Ewa Rajpert-De Meyts, Kopenhaga, Dania (Copenhagen, Denmark)
dr n. med. Aleksandra Robacha, Łódź
dr n. med. Maria Szarras-Czapnik, Warszawa
dr n. med. Renata Walczak-Jędrzejowska, Łódź
lek. Jan Karol Wolski, Warszawa
Adres redakcji:
Zakład Histologii i Biologii Rozwoju
Wydział Nauk o Zdrowiu
Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie
71-210 Szczecin ul. Żołnierska 48
tel. 91 48 00 917, 91 48 00 908
e-mail: mpiasecka@ipartner.com.pl
Projekt graficzny:
Waldemar Jachimczak
Małgorzata Piasecka
Kamil Gill
Korekta języka polskiego:
Małgorzata Piasecka
Kamil Gill
Korekta języka angielskiego:
Małgorzata Piasecka
Kamil Gill
Skład i łamanie:
Waldemar Jachimczak

KONFERENCJA POLSKIEGO TOWARZYSTWA ANDROLOGICZNEGO – 22. DZIEŃ ANDROLOGICZNY Konferencja hybrydowa

KONFERENCJA POLSKIEGO TOWARZYSTWA ANDROLOGICZNEGO – 22. DZIEŃ ANDROLOGICZNY Konferencja hybrydowa Warszawa, 14–15.05.2021; www.pta2020.pl

Streszczenia wykładów

Szymon Bakalczuk1, Grzegorz Bakalczuk2 EMPIRYCZNE METODY LECZENIA MĘSKIEJ NIEPŁODNOŚCI

1Ovum Rozrodczość i Andrologia, Lublin, 2Zakład Położnictwa, Ginekologii i Pielęgniarstwa Położniczo-Ginekologicznego, Wydział Nauk o Zdrowiu, Uniwersytet Medyczny w Lublinie
e-mail: szymonbakalczuk@o2.pl
Wiele obecnych badań wykazało, że niedobór w organizmie mężczyzny mikroelementów, antyoksydantów czy witamin wyraźnie wpływa na obniżenie parametrów nasienia takich jak ruchliwość czy liczba plemników, co może powodować obniżenie płodności u mężczyzn, u których występują niedobory tych elementów. W związku z tym wydaje się zasadne podawanie suplementów diety zawierających brakujące elementy takie jak cynk, miedź, selen, L-karnityna, koenzym Q10, kwas foliowy (Ali i wsp.: Andrologia. 2021, 53 (1), e13644; Busetto i wsp.: Andrologia 2020, 52(3), e13523; Busetto i wsp.: Andrologia. 2018, 50(3), e12927)). Badania przeprowadzone przez wielu autorów na mężczyznach, u których stwierdzono problemy z płodnością spowodowane obniżonymi parametrami nasienia potwierdziły, że stosowanie suplementów diety może wyraźnie poprawić jakość nasienia tych mężczyzn i przyczynić się do uzyskania przez nich upragnionego potomstwa. Obecnie na polskim rynku dostępnych jest kilka suplementów diety proponowanych mężczyznom starającym się o potomstwo, które poprawiają ruchliwość, liczbę plemników, ich morfologię oraz objętość niesienia. Preparaty te nie są jednoskładnikowe, ale zawierają wiele składników, wzajemnie uzupełniających się i wzmagających swoje działanie. Dostępne na rynku preparaty różnią się od siebie nie tylko składem, ale także ilością zawartych w nich elementów. Małgorzata Brzoskwinia1, Laura Pardyak2, Alicja Kamińska1, Wacław Tworzydło3, Anna Hejmej1, Sylwia Marek1, Barbara Bilińska1 AKTYWNOŚĆ STEROIDOGENNA KOMÓREK LEYDIGA A ULTRASTRUKTURA ICH MITOCHONDRIÓW

1Zakład Endokrynologii, Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych, Wydział Biologii, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie, 2Ośrodek Medycyny Eksperymentalnej i Innowacyjnej, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie, 3Zakład Biologii Rozwoju i Morfologii Bezkręgowców, Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych, Wydział Biologii, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie e-mail: m.brzoskwinia@doctoral.uj.edu.pl

Androgeny, w tym testosteron, odgrywają kluczową rolę w regulacji męskich funkcji reprodukcyjnych, wywołując biologiczne efekty dzięki wiązaniu z receptorami androgenowymi (AR, ang. androgen receptor). Głównym źródłem wewnątrzjądrowego testosteronu są komórki Leydiga, które, tak jak inne komórki steroidogenne, syntetyzują testosteron z cholesterolu. Transport cholesterolu do mitochondriów i kolejne konwersje steroidów do testosteronu wymagają obecności specyficznych białek i enzymów (Haider: Int Rev Cytol. 2004, 233, 181–241). Należy podkreślić, że prawidłowa produkcja androgenów jest uwarunkowana stanem strukturalnym komórek Leydiga, a każde zaburzenie dostępu tych hormonów może wpływać na aktywność sekrecyjną tych komórek. W naszych badaniach stosowano flutamid – czysty niesteroidowy anty-androgen, który blokuje wiązanie androgenów z AR, zaburzając działanie testosteronu (Labrie: Cancer. 1993, 72, 3816–3827). Pomimo licznych badań dotyczących długotrwałych skutków podania flutamidu, niewiele jest danych dotyczących krótkoterminowego ograniczenia sygnalizacji androgenowej. Wieloletnie badania Zespołu Profesor Bilińskiej wykazały, iż krótkotrwała ekspozycja dojrzałych płciowo samców szczurów na flutamid, skutkuje nieprawidłowym stanem czynnościowym bariery krew-jądro (Zarzycka i wsp.: Andrology. 2015, 3, 569–581; Chojnacka i wsp.: Reprod Biol Endocrinol. 2016, 14, 14). Wyniki pracy Sarabaya i wsp. (Sarrabay i wsp.: Toxicol Appl Pharmacol. 2015, 289, 515–524) wskazują, iż zablokowanie AR prowadzi do zahamowania ujemnego sprzężenia zwrotnego w osi podwzgórze-przysadka-jądro i do wzmocnienia aktywności komórek Leydiga. W tym kontekście, pogłębienie wiedzy na temat wpływu flutamidu na przedział interstycjalny gonady męskiej, aktywność steroidogenną komórek Leydiga i ich potencjalną autoregulację wydaje się ważne poznawczo. Rezultaty ostatnich badań autorskich (Brzoskwinia i wsp.: J Mol Sci. 2020, 21, 4439) pokazują, iż zaburzenie sygnalizacji androgenowej przez flutamid prowadzi do podniesienia stężeń hormonu luteinizującego, cholesterolu i testosteronu w osoczu krwi szczurów. Co istotne, zanotowano również zwiększony poziom wewnątrzjądrowego testosteronu, wyraźnie korelujący ze zwiększoną ekspresją białek mitochondriach zaangażowanych w przebieg pierwszego etapu steroidogenezy. Analiza morfometryczna półcienkich skrawków jąder uwidoczniła znamienne zwiększenie powierzchni komórek Leydiga, natomiast analiza ultrastrukturalna pozwoliła na obserwację zróżnicowanych zmian w budowie i rozmieszczeniu mitochondriów. Wzajemne relacje między organellami komórkowymi, wizualizowane dzięki komputerowym rekonstrukcjom 3D komórek Leydiga, uwidoczniły tworzenie lokalnych sieci mitochondrialnych. Ponadto, analiza morfometryczna mitochondriów potwierdziła znaczące zwiększenie zajmowanej przez nie powierzchni w komórce. Podsumowując, zwiększona aktywność komórek Leydiga może być związana ze zwiększoną ilością i dynamiką mitochondriów. Wzrost ekspresji białka biorącego udział w podziale tych organelli (Drp1, ang. dynamin related protein 1) wydaje się potwierdzać tę sugestię. Wyniki naszych badań wskazują zatem, że zablokowanie AR indukuje mechanizm kompensacyjny, prowadzący do nasilenia steroidogennej funkcji komórek Leydiga. Badania finansowane przez Narodowe Centrum Nauki, grant OPUS12 2016/23/B/NZ4/01788

Michał Duliban1, Piotr Pawlicki2, Agnieszka Miloń1, Ewelina Górowska-Wójtowicz1, Barbara Bilińska1, Małgorzata Kotula-Balak2 GENETYCZNA KONTROLA FUNKCJONOWANIA KOMÓREK JĄDRA W STANIE ZDROWIA I CHOROBY

1Zakład Endokrynologii, Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie, 2Uniwersyteckie Centrum Medycyny Weterynaryjnej UJ-UR, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie e-mail: michal.duliban@doctoral.uj.edu.pl W gonadzie męskiej estrogeny na drodze parakrynnej i autokrynnej regulują funkcję spermatogeniczną i steroidogenną. Obecnie wiadomo, że w komórkach Leydiga estrogeny działają przez różne typy receptorów estrogenowych (Pardyak i wsp.: Tissue Cell. 2016, 48, 432– 441; Chimento i wsp.: Cells. 2020, 9, 2115). Patologiczne komórki Leydiga mogą produkować nieprawidłową ilość estrogenów np. ludzkie nowotworowe komórki Leydiga charakteryzują się często nadprodukcją estrogenów i ich metabolitów (Van Der Gucht i wsp.: Clin. Nuclear Med. 2018, 43, 41–43). Nasze badania wykazały istotne różnice w ekspresji genów w zdrowych i nowotworowych komórkach Leydiga człowieka (Kotula-Balak i wsp.: nieopublikowane). Szczegółowe opracowanie otrzymanych wyników ujawniło w komórkach nowotworowych zaburzenia ekspresji genów związanych z takimi procesami jak: apoptoza, rozwój naczyń krwionośnych czy stres komórkowy. Mutacja genu TP53, prowadząca do osłabionej apoptozy, została opisana również u pacjentów z guzami jąder (Stecher i wsp.: Pediatr Blood Cancer. 2008, 50, 701–703). Ponadto, zaobserwowano obniżenie poziomu ekspresji genów kodujących białka szoku cieplnego. W oparciu o wyniki analizy sekwencjonowania nowej generacji (NGS, ang. next generation sequencing) (nowoczesna metoda pozwalająca na szybką i dokładną analizę całego materiału genetycznego komórki, tkanki lub organu), przeprowadzonej w gonadach myszy z zakłóconą nieklasyczną sygnalizacją estrogenową (przez receptory pokrewne receptorom estrogenowym i błonowy receptor estrogenowy) stwierdzono zmiany ekspresji genów zaangażowanych w procesy istotne dla funkcjonowania poszczególnych komórek gonady, takie jak odpowiedź immunologiczna czy potranslacyjne modyfikacje białek (Duliban i wsp.: Reprod Fertil Dev 2020, 32, 903–913). Załamanie równowagi immunologicznej jądra może przyczyniać się do zaburzeń płodności, a nieprawidłowości potranslacyjnych modyfikacji białek mogą sprzyjać rozwojowi procesów patologicznych, takich jak nowotworzenie (Han i wsp.: Int. J Oncol. 2018, 52, 1081–1094.). Potwierdzają to istotne zmiany ekspresji kilku genów takich jak Bmi1 (ang. polycomb ring finger oncogene), Npm1 (ang. nucleophosmin 1), które aktywnie uczestniczą w przyśpieszonym rozwoju nowotworów. Dzięki zastosowaniu techniki NGS, uzyskane kompleksowe dane dostarczają przekrojowych informacji o aktywności transkryptomu jądra lub poszczególnych typów komórek i mogą posłużyć do zainicjowania dalszych badań na poziomie proteomu, epigenomu oraz opracowania nowych testów diagnostycznych. Badania finansowane przez Narodowego Centrum Nauki, grant SONATA BIS5. 2015/18/E/NZ4/00519 oraz OPUS12 2016/23/B/NZ4/01788

Kamil Gill1, Aleksandra Rosiak-Gill1,2, Małgorzata Piasecka1 ZNACZENIE USZKODZEŃ CHROMATYNY PLEMNIKÓW LUDZKICH W WARUNKACH ZAPŁODNIENIA POZAUSTROJOWEGO

1Zakład Histologii i Biologii Rozwoju, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie; 2Vitrolive Centrum Ginekologii i Leczenia Niepłodności, Szczecin e-mail: kamil.gill@pum.edu.pl

Na przestrzeni ostatnich dekad niepłodność partnerska stała się jednym z istotnych problemów współczesnej medycyny, czego wyrazem jest zaliczenie jej przez Światową Organizację Zdrowia do chorób cywilizacyjnych. (Agarwal i wsp.: World J Mens Health. 2019, 37 (3), 296–312). Odpowiedzią na ten problem stał się rozwój technik wspomaganego rozrodu, szczególnie zapłodnienia pozaustrojowego (łac. in vitro), które dla wielu par jest jedyną szansą na posiadanie biologicznego potomstwa. Mimo, że kliniczne znaczenie standardowej oceny seminologicznej w przypadku procedury in vitro zostało mocne ograniczone, wpływ męskiego czynnika na sukces reprodukcyjny nie został całkowicie wyeliminowany. Potwierdzają to wyniki badań, w których nie uzyskano ciąży przy braku czynnika żeńskiego jako przyczyny niepłodności partnerskiej. Dlatego też, wielu autorów podkreśla, konieczność wdrożenia oceny molekularnych biomarkerów męskiej niepłodności (Agawrwal i wsp.: Int J Mol Sci. 2020, 21(11), 3882; Jerre i wsp.: Fertil Steril. 2019, 112(1), 46–53; Tang i wsp.: J Gynecol Obstet Hum Reprod. 2020, 10, 101868). Celem tych procedur jest umożliwienie prognozowania szans na uzyskanie ciąży w warunkach zapłodnienia in vitro. W tym aspekcie szczególne znaczenie przypisuje się jakości chromatyny plemników. Jej wpływ obserwowany może być na etapie zapłodnienia, tworzenia się przedjądrzy i wczesnego rozwoju zarodka, przed pełną aktywacją ojcowskiego genomu (zarodek 4-blastomerowy) – wczesny wpływ czynnika męskiego (ang. early paternal effect). Ponadto, ujawnia się późny wpływ czynnika męskiego (ang. late paternal effect), który ma miejsce na etapie 4–8-blastomerowego zarodka, gdy dochodzi do pełnej aktywacji ojcowskiego genomu i trwa aż do osiągnięcia przez zarodek stadium blastocysty. Stąd też, liczni badacze wskazują, że nieprawidłowości w integralności/dojrzałości chromatyny męskich komórek rozrodczych mogą być przyczyną: 1) spadku odsetka prawidłowo zapłodnionych oocytów i zarodków morfologicznie prawidłowych, 2) spadku odsetka uzyskiwanych ciąż oraz 3) wzrostu częstości poronień a nawet częstości wad wrodzonych i zaburzeń epigenetycznych u potomstwa (Okada i Yamaguchi: Cell. Mol. Life Sci. 2017, 74, 1957–1967; Tesarik: Reprod Biomed Online. 2005, 10(3), 370–375). Jednak nie wszyscy badacze jednoznacznie potwierdzają negatywny wpływ uszkodzeń chromatyny plemników na sukces rozrodczy w warunkach in vitro (Green i wsp.: J Assist Reprod Genet. 2020, 37(1), 71–76; Yang i wsp.: Transl Androl Urol. 2019, 8(4), 356–365). Może być to związane z wykorzystaniem różnych metod selekcji męskich gamet, procedur zapłodnienia in vitro i testów oceny statusu chromatyny plemników oraz odmiennych narzędzi statystycznych. Co więcej, obserwuje się dużą heterogenność grup objętych badaniami. Nie można również pominąć faktu, że oocyt wyposażony jest w systemy naprawy DNA. Przede wszystkim naprawiane są pojedyncze nacięcia jądrowego DNA plemników. Proces ten może rozpocząć się na etapie przedjądrzy i trwać do osiągnięcia przez zarodek stadium blastocysty. Jeśli skala uszkodzeń DNA męskich komórek rozrodczych nie przekracza zdolności naprawczych oocytu, wpływ tych uszkodzeń może zostać ograniczony (Ribas-Maynou i Benet: Genes (Basel). 2019, 10(2), 105). Niejednoznaczność tych danych, skłania do wciąż toczącej się dyskusji na temat klinicznej wartości testów weryfikujących jakość jądrowego DNA plemników w prognozowaniu sukcesu reprodukcyjnego w warunkach in vitro. Badania finansowane przez Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie (nr badań: WNoZ-322-01/S/19/2021).

BEZPOŚREDNIA KOMUNIKACJA MIĘDZYKOMÓRKOWA W NABŁONKU PLEMNIKOTWÓRCZYM I JEJ FUNKCJONOWANIE W WARUNKACH OGRANICZONEGO DOSTĘPU ANDROGENÓW

Anna Hejmej, Alicja Kamińska, Sylwia Marek, Barbara Bilińska

Zakład Endokrynologii, Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie
e-mail: anna.hejmej@uj.edu.pl

Komunikacja między komórkami gonady męskiej jest przedmiotem szczególnego zainteresowania badaczy z uwagi na kluczową rolę tych odziaływań w utrzymaniu prawidłowego przebiegu spermatogenezy. Pierwotnie badania koncentrowały się na komunikacji parakrynowej (Bilińska i wsp.: Biol Cell. 1997, 89, 435–442), lecz w kolejnych latach wykazano, że równie istotne są interakcje oparte na bezpośrednim kontakcie komórek. Komunikacja taka polega na międzykomórkowym transporcie substancji drobnocząsteczkowych poprzez połączenia szczelinowe lub na oddziaływaniach pomiędzy cząsteczkami zlokalizowanymi w błonach sąsiadujących komórek (sygnalizacja jukstakrynowa). Połączenia szczelinowe zbudowane są z białek – koneksyn, które tworzą kanały łączące cytoplazmy kontaktujących się ze sobą komórek. W jądrze ssaków połączenia te buduje głównie koneksyna 43 (Cx43, ang. connexin 43). Badania z wykorzystaniem myszy z nokautem genu kodującego Cx43 w komórkach Sertolego ujawniły krytyczne znaczenie tego białka w różnicowaniu komórek Sertolego i inicjacji spermatogenezy (Brehm i wsp.: Am J Pathol. 2007, 171, 19–31; Chojnacka i wsp.: Reprod Biol. 2012, 12, 341– 346). W jądrze mężczyzn oraz gryzoni z upośledzoną spermatogenezą wykazano zaburzenia ekspresji Cx43 (Kotula-Balak i wsp.: Eur J Histochem. 2007, 51, 261– 268). Doświadczenia na szczurach poddanych działaniu anty-androgenu flutamidu dowiodły, że zablokowanie sygnalizacji androgenowej skutkuje obniżoną immunoekspresją oraz delokalizacją Cx43 w rejonie bariery krew-jądro, czemu towarzyszy zmieniona dystrybucja białka połączeń ścisłych ZO-1 (ang. zonula occludens 1) oraz nieprawidłowości strukturalne bazalnych specjalizacji powierzchniowych. Wyniki te wskazują, że prawidłowa komunikacja między komórkami Sertolego z udziałem Cx43 jest uwarunkowana dostępnością androgenów (Chojnacka i wsp.: Reprod Biol Endocrinol. 2016, 31, 14, 14). Drugi, wspomniany wcześniej, mechanizm bezpośredniej komunikacji międzykomórkowej w gonadzie męskiej – komunikacja jukstakrynowa – obejmuje działanie szlaku sygnałowego Notch. Aktywacja tego szlaku następuje w wyniku związania błonowego receptora Notch ze specyficznymi ligandami zlokalizowanymi w błonie sąsiadującej komórki. Skutkuje to proteolizą receptora i translokacją jego wewnątrzkomórkowej domeny do jądra komórkowego, gdzie reguluje ona transkrypcję genów z rodziny Hes (ang. hairy/enhancer of split) i Hey (ang. Hes-related with YRPW motif). Optymalna aktywność tego szlaku warunkuje prawidłowy przebieg różnicowania spermatogonialnych komórek macierzystych oraz wpływa na dalsze etapy spermatogenezy, a w konsekwencji na płodność (Garcia i wsp.: Development. 2014, 141, 4468–4478; Murta i wsp.: PLoS One. 2014, 9, e113365). Zaburzony poziom ekspresji białek szlaku Notch stwierdzono w raku jądra oraz u mężczyzn azoospermią nieobturacyjną (Hayashi i wsp.: J Androl. 2001, 22, 999–1011; Hayashi i wsp.: Tumour Biol, 2004, 25, 99–105). Nasze ostatnie badania wskazują, że w warunkach ograniczonego dostępu androgenów w wyniku zablokowania receptora androgenowego lub selektywnej eliminacji komórek Leydiga, w nabłonku plemnikotwórczym szczura następują zmiany ekspresji receptorów Notch1 i Notch2, a także ich aktywowanych form. Stwierdzono ponadto zmiany ekspresji genów efektorowych Hey1, Hes1 i Hes5, co świadczy o zaburzeniu aktywności szlaku Notch. Androgeny można zatem uważać za regulatory sygnalizacji Notch (Kamińska i wsp.: Reprod Biol Endocrinol. 2020, 18, 30). Prezentowane badania dowodzą, że kontrola bezpośredniej komunikacji międzykomórkowej w nabłonku plemnikotwórczym stanowi jeden z istotnych aspektów działania androgenów w przebiegu spermatogenezy. Tym samym nieprawidłowości zarówno w komunikacji z udziałem złącz szczelinowych, jak i sygnalizacji jukstakrynowej mogą leżeć u podłoża zakłóceń plemnikotwórczej funkcji jądra w warunkach ograniczonego dostępu tych hormonów. Badania finansowane przez Narodowe Centrum Nauki, granty HARMONIA3 2012/06/M/NZ4/00146 i OPUS13 2017/25/B/ NZ4/01037.

Katarzyna Jankowska

Sposób IMMUNOLOGICZNE ASPEKTY NIEPŁODNOŚCI MĘSKIEJ

Niepłodność męska może być spowodowana zaburzeniami immunologicznymi. Niepłodność immunologiczną u mężczyzn definiuje się jako obecność u jednego lub obydwojga partnerów reakcji immunologicznej przeciw nasieniu (Dondero i wsp.: W: Oxford Textbook of Endocrinology and Diabetes, Oxford University Press, 2011, DOI: 10.1093/med/9780199235292.003.9100). Wytyczne Światowej Organizacji Zdrowie (WHO, ang. World Health Organization) podają czynniki immunologiczne jako jedną z przyczyn niepłodności męskiej (WHO: Manual for the Standardized Investigation and Diagnosis of the Infertile Couple. Cambridge University Press, 2000). Szacuje się, że ok. 15% męskiej niepłodności ma podłoże immunologiczne, albo z powodu powtarzających się infekcji, albo nieprawidłowej odpowiedzi autoimmunologicznej dotyczącej najądrzy, prostaty lub jąder. Wskaźnik ten prawdopodobnie jest niedoszacowany, ponieważ podaje się, że 30% przypadków niepłodności u mężczyzn ma charakter idiopatyczny. W przeciwieństwie do zapalenia jąder, zapalenie najądrzy jest częstym schorzeniem. Jego przyczyną są częste infekcje bakteryjne, szczególnie istotne znaczenie mają przenoszone drogą płciową Chlamydia trachomatis i Neisseria gonorrhoeae u młodych mężczyzn oraz jelitowe Escherichia coli i Enterococcus faecalis u starszych mężczyzn. Wykazano, że infekcje te, nawet jeśli są skutecznie leczone, mogą wywoływać zwężenie przewodu najądrza, zmniejszenie liczby plemników i azoospermię nawet u 40% pacjentów. Dane kliniczne wskazują na potrzebę skutecznej i precyzyjnie kontrolowanej odpowiedzi immunologicznej na patogeny w najądrzu. Przeciwciała przeciwplemnikowe (ASA, ang. antisperm antibodies) mogą interferować ze zdolnością zapładniającą nasienia: obniżać ruchliwość plemników, obniżać zdolność do przejścia przez wydzielinę dróg rodnych u kobiety, obniżać zdolność penetracji oocytu, powodować aglutynację plemników. Przeciwciała przeciwplemnikowe powodują zmniejszoną ruchliwość plemników czyli astenozoospermii. Niepłodność immunologiczną należy jednak wziąć pod uwagę także przy normozoospermii, zwłaszcza kiedy testy czynnościowe plemników nie są prawidłowe. Rekomendacje Europejskiego Towarzystwa Urologicznego zalecają rozważenie diagnostyki w kierunku zaburzeń immunologicznych, kiedy wynik badania nasienia nie mieści się w zakresie referencyjnym w dwóch kolejnych analizach. Weryfikację tę wykonuje się, gdy wykluczono inne przyczyny nieprawidłowego seminogramu (np. infekcję dróg moczowo-płciowych). Obecnie zaleca się wykonywanie mieszanego testu antyglobulinowego (MAR, ang. mixed antiglobulin reaction) lub testu wiązania immunologicznego (ang. immunobead test) z nasienia (Jungwirth i wsp.: Male Infertility W: EAU Guidelines, http://uroweb.org/guideline/male- -infertility). Test MAR służy do wykrywania przeciwciał przeciwplemnikowych w nasieniu. Wykonanie testu warto rozważyć, gdy w badaniu nasienia stwierdza się małą ruchliwość plemników lub aglutynację plemników. Uprzednio należy wykluczyć infekcję dróg moczowo- -płciowych, ponieważ może ona indukować obecność przeciwciał. Jeśli mimo braku infekcji czy po wyleczeniu infekcji, nadal stwierdza się astenozoospermię czy aglutynację plemników, należy wykluczyć niepłodność o podłożu immunologicznym. Test MAR polega na tym, że do próbki nasienia dodaje się kuleczki lateksu pokryte przeciwciałami IgA lub IgG oraz mieszaninę przeciwciał anty-IgA lub anty-IgG. Jeżeli na plemnikach występują przeciwciała IgA lub IgG – dochodzi do połączenia plemników z kuleczkami, co obserwuje się w mikroskopie. Wynik powyżej 50% plemników związanych z kuleczkami traktuje się jako pozytywny i oznacza on obecność przeciwciał przeciwplemnikowych w ilości zaburzającej funkcję plemników (możliwość przenikania przez śluz szyjki macicy, a także zdolność do zapłodnienia). Test ten można wykonywać jedynie wtedy, gdy w nasieniu znajdują się plemniki wykazujące ruch. Podobne znaczenie ma test wiązania immunologicznego. Jest on dokładniejszy niż test MAR, ale wykonanie jest bardziej pracochłonne. Test ten nie jest wykonywany ze świeżej próbki nasienia ale z nasienia, z którego wcześniej usunięto elementy mogące maskować obecność przeciwciał. Zasada działania testu jest podobna jak testu MAR (połączenie plemników z kuleczkami lateksu obserwuje się w mikroskopie). Ocena wyniku testu wiązania immunologicznego także jest podobna: ≥50% plemników związanych z kuleczkami oznacza wynik pozytywny, wskazujący na występowanie przeciwciał przeciwplemnikowych w ilości zaburzającej funkcję plemników. Analizę tę można wykonywać jedynie wtedy, gdy w nasieniu znajdują się plemniki wykazujące ruch. W regulacji odpowiedzi immunologicznej podkreśla się rolę najądrzy (Voisin i wsp.: Asian J Androl. 2019, 21(6), 531–539). Komórki nabłonka najądrzy rozwinęły mechanizmy, które zwalczają patogeny, w tym ekspresję różnych receptorów TLR (ang. toll-like receptors), cząsteczek przeciwbakteryjnych (tlenek azotu, IDO, β-defensyny itp.) oraz cytokin prozapalnych (IL-1, IL-6 itp.). Śródmiąższowe limfocyty B w najądrzach mogą być odpowiedzialne za wydzielanie lokalnych IgA lub mogą fagocytozować bakterie opłaszczone przeciwciałami i ograniczać ich rozprzestrzenianie się w tkance oraz indukować specyficzne efektorowe limfocyty T. Aktywowane komórki B aktywują pomocnicze komórki T. W zależności od populacji komórek prezentujących antygen (APC, ang. antigen-presenting cell), niektóre komórki mogą migrować do drenującego węzła chłonnego, aby wywołać rekrutację komórek efektorowych do zakażonych najądrzy. W przypadku uszkodzenia nabłonka spowodowanego infekcją, niektóre monocyty CX3CR1+ CD11c+ mogą uczestniczyć w eliminacji rozpadłych komórek lub patogenów. Nowo zidentyfikowane limfocyty T w najądrzu mogą być aktywowane przez APC lub bezpośrednio przez zakażone komórki. Po aktywacji mogą stać się cytotoksyczne, uczestnicząc w usuwaniu bakterii. Prawdopodobnie najądrze jest potencjalnym rezerwuarem odpornościowym komórek cytotoksycznych podczas infekcji. Niepłodność immunologiczną stwierdza się u 8–20% niepłodnych mężczyzn. Przeciwciała przeciwplemnikowe pojawiają się w wyniku urazu, infekcji jądra lub najądrza, które prowadzą do przerwania bariery krew- -jądro (np. operacje, infekcje, żylaki powrózka nasiennego). Nie wszystkie przeciwciała przeciwplemnikowe powodują niepłodność. Istotne jest czy przeciwciała te wiążą epitopy antygenów niezbędnych do zapłodnienia komórki jajowej. Obecnie rekomenduje się wykonywanie testów wykrywających przeciwciała przeciwplemnikowe: test MAR lub test wiązania immunologicznego. W zależności od wywiadu (łuszczyca, bielactwo, choroby tarczycy, choroby zapalne jelit, choroby reumatologiczne) do rozważenia pozostaje skrining w kierunku innych chorób autoimmunizacyjnych (ANA, anty-TPO, antyTg, anty-CCP, celiakia). W wielu chorobach o podłożu autoimmunizacyjnym możliwe jest leczenie przyczynowe (np. leki biologiczne).W ostatnim czasie zwraca się większą uwagę na związek między stanem układu odpornościowego a płodnością. W 2018 r. Brubaker i wsp. (Brubaker i wsp.: Andrology. 2018, 6(1), 94–98) wykazali, że u niepłodnych mężczyzn występuje wyższa częstość zachorowań na choroby autoimmunizacyjne: reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane, łuszczycę, zapalenie tarczycy i chorobę Graves’a-Basedowa. Hipogonadyzm może być jedną ze składowych zespołu autoimmunizacyjnej poliendokrynopatii. Z drugiej strony inne publikacje (Mouvis i wsp.: Semin Arthritis Rheum. 2019, 48(5), 911–920) wykazują, że u mężczyzn z chorobami reumatologicznymi, u których stosuje się np. leki z grupy anty-TNF (ang. anti-tumor necrosis factor), obserwuje się poprawę parametrów nasienia i zwiększenie odsetka ciąż u partnerek. Potwierdzałoby to znaczenie procesów autoimmunizacyjnych w niepłodności u mężczyzn. Te bardzo ciekawe informacje wymagają dalszych badań naukowych i obserwacji klinicznych. -->

Piotr Jędrzejczak AZOOSPERMIA, DIAGNOSTYKA I PLANOWANIE POSTĘPOWANIA

Klinika Niepłodności i Endokrynologii Rozrodu Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu e-mail: piotrjedrzejczak@gmail.commanuskryptu

Azoospermia dotyczy około 1% mężczyzn. Stanowi poważne wyzwanie dla lekarzy zajmujących się medycyną rozrodu. Podczas prezentacji przedstawione zostaną przyczyny występowania, oraz metody diagnostyczne istotne w wykryciu poszczególnych form tego schorzenia. Szczególna uwaga poświęcona zostanie aktualnym możliwościom terapeutycznym u mężczyzn z całkowitym brakiem plemników w ejakulacie. Na koniec zaprezentowany zostanie algorytm postępowania u pacjenta z azoospermią według współczesnych rekomendacji.

ROLA I REGULACJA HORMONALNA BIAŁEK Z RODZINY JAGGED I DELTA-LIKE W KOMÓRKACH SERTOLEGO GRYZONI

Alicja Kamińska, Sylwia Marek, Małgorzata Brzoskwinia, Laura Pardyak, Anna Hejmej, Barbara Bilińska

Zakład Endokrynologii, Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych, Wydział Biologii, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie; 2Ośrodek Medycyny Eksperymentalnej i Innowacyjnej, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie e-mail: ala.kaminska@uj.edu.pl

Proces spermatogenezy u ssaków jest kontrolowany przez komórki Sertolego, uważane za kluczowe mediatory działania androgenów w nabłonku nasiennym. Główną drogą działania androgenów jest aktywacja klasycznego wewnątrzkomórkowego receptora androgenowego (AR, ang. androgen receptor). Obecnie wiadomo, że prawidłowa sygnalizacja AR w komórkach Sertolego jest niezbędna do utrzymania bariery krew-jądro oraz przebiegu mejozy i procesu spermiacji (O’Hara i Smith: Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2015, 29, 595–605). Androgeny wpływają na proces spermatogenezy również poprzez nieklasyczne ścieżki sygnałowe, związane z indukcją receptorów błonowych. W 2014 r. zidentyfikowano błonowy receptor androgenowy ZIP9 (ang. Zrt- and Irt-like protein 9) – białko należące do rodziny błonowych transporterów cynku (Berg i wsp.: Endocrinology. 2014, 155, 4237–4249). Wykazano, że w szczurzych komórkach Sertolego testosteron działając przez ZIP9 bierze udział w regulacji białek bariery krew-jądro (Bulldan i wsp.: Cell Signal. 2016, 28, 1075–1085). Ostatnie badania potwierdziły, że ZIP9 jest zlokalizowany w komórkach Sertolego myszy i nornicy rudej (Kamińska i wsp.: Andrology. 2020, 8, 457–472; Profaska-Szymik i wsp.: Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 6888). Białka Delta-like (DLL) i Jagged (JAG) są błonowymi ligandami aktywującymi szlak sygnałowy Notch, uczestniczący w bezpośredniej komunikacji międzykomórkowej w nabłonku plemnikotwórczym. W jądrach myszy oraz szczura wykazano obecność ligandów DLL1, DLL4 oraz JAG1 zarówno w komórkach Sertolego, jak i komórkach plemnikotwórczych (Kamińska i wsp.: Reprod Biol Endocrinol. 2020, 18, 30; Murta i wsp.: PLoS One. 2013, 8, e72767). Wyniki analiz z wykorzystaniem linii komórek Sertolego dowiodły, że aktywacja szlaku Notch przez poszczególne ligandy w specyficzny sposób moduluje odpowiedź tych komórek na androgeny, wpływając na ekspresję AR i ZIP9. Stwierdzono ponadto, że zaburzenia aktywności szlaku Notch prowadzą do deregulacji ekspresji androgenozależnych białek bariery krew jądro – klaudyn (Kamińska i wsp.: Andrology. 2020, 8, 457–472). Szlak Notch może być zatem uważany za ważny czynnik wpływający na funkcjonowanie sygnalizacji androgenowej w komórkach Sertolego. Dalsze analizy wykazały, że ekspresja ligandów szlaku Notch (DLL1, DLL4 i JAG1) w gonadzie męskiej jest regulowana przez androgeny. Badania na modelach in vitro przyczyniły się do wyjaśnienia mechanizmu tej regulacji, dowodząc, że uczestniczą w niej zarówno AR, jak i ZIP9. Wyniki te wskazują na udział klasycznej i nieklasycznej sygnalizacji androgenowej w kontroli szlaku Notch. Przedstawione badania świadczą o dwukierunkowej interakcji między białkami Delta-like i Jagged a sygnalizacją androgenową w kanalikach nasiennych gryzoni. Współdziałanie tych mechanizmów stanowi istotny czynnik regulujący fizjologię komórek Sertolego, a jego zaburzenia mogą skutkować zakłóceniem procesów kluczowych dla przebiegu spermatogenezy, takich jak funkcja bariery krew-jądro. Badania finansowane przez Narodowe Centrum Nauki, granty MINIATURA1 2017/01/X/NZ4/00285 oraz OPUS13 2017/25/B/NZ4/01037.

NIEKLASYCZNA SYGNALIZACJA ESTROGENOWA W TKANCE INTERSTYCJALNEJ JĄDRA

Małgorzata Kotula-Balak1, Agnieszka Miłoń1, Piotr Pawlicki1, Ewelina Górowska-Wójtowicz2, Michał Duliban2, Barbara Bilińska2

1Uniwersyteckie Centrum Medycyny Weterynaryjnej UJ-UR, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie, 2Zakład Endokrynologii, Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie e-mail: malgorzata.kotula-balak@urk.edu.pl

Na podstawie wieloletnich badań epidemiologicznych i eksperymentalnych wiadomo, że sygnalizacja estrogenowa z udziałem klasycznych i nieklasycznych receptorów estrogenowych jest konieczna dla prawidłowego funkcjonowania męskiego układu płciowego. Pod koniec XX w. zidentyfikowano oraz określono rolę klasycznych receptorów estrogenowych α i β (ERα i ERβ, ang. estrogen receptor α and β) w funkcji różnych typów komórek jądra przy wykorzystaniu zwierzęcych modeli eksperymentalnych i badań in vitro (Bilińska i wsp.: Mol Cell Endocrinol. 2001, 10, 189–198; Hess.: Reprod Biol Endocrinol. 2003, 9, 52). W jądrze człowieka, w tym także patologicznym, wykazano ekspresję genów ERα i ERβ, jednak badania zmierzające do określenia wzoru lokalizacji białek tych receptorów wciąż są prowadzone. Obecnie prace badawcze skoncentrowane są na wyjaśnianiu roli nieklasycznych receptorów estrogenowych tj. receptorów pokrewnych receptorom estrogenowym (ERRα, ERRβ i ERRγ, ang. estrogen-related receptor α, β and γ), których sekwencje DNA wykazują wysoką homologię do sekwencji ER, oraz błonowego receptora estrogenowego (GPER, ang. G-protein coupled estrogen receptor). W ostatnich latach po raz pierwszy stwierdzono ekspresję ERR w komórkach Leydiga myszy warunkach in vitro oraz in vivo. W nowotworowych komórkach Leydiga pozbawionych aktywności ERRα, ERRβ lub ERRγ obserwowano zmiany w ich proliferacji, apoptozie i migracji (Kotula-Balak i wsp.: Tissue Cell. 2018, 52, 78–91). Gatunkowo-specyficzną ekspresję GPER wykazano we wszystkich typach komórek jądra ssaków, w tym także u człowieka (Fietz i wsp.: Methods Mol Biol. 2016, 1366, 189–205; Kotula-Balak i wsp.: Cell Tissue Res. 2018, 374, 389–412). Wzrost ekspresji GPER oraz zmiany stężenia estrogenów notowano w nowotworze komórek Leydiga gryzoni i człowieka (Górowska-Wojtowicz i wsp.: Tissue Cell. 2019, 61, 51–60). Inaktywacja zarówno ERR jak i GPER w gonadach myszy skutkowała zwiększeniem objętości tkanki interstycjalnej/śródmiąższowej oraz wzrostem ekspresji genów ERRα, ERRβ lub ERRγ. Równocześnie stwierdzono wzrost liczby telocytów – nowoodkrytych regulatorowych komórek tkanki interstycjalnej (Pawlicki i wsp.: Protoplasma. 2019, 256, 393-408). Dzięki unikalnej budowie i dystrybucji telocytów w tkance śródmiąższowej, komórki te tworzą sieci strukturalno-komunikacyjne, regulując funkcję steroidogenną komórek Leydiga pod kontrolą ERR i GPER. Zatem rozrost tkanki interstycjalnej w stanach patologicznych gonady może być wynikiem zakłóceń w liczbie i/lub funkcji telocytów oraz ich regulacji przez sygnały hormonalne odbierane przez wymienione receptory. W świetle powyżej przedstawionych wyników badań wydaje się, że nieklasyczne receptory estrogenowe są obok ER istotnym ogniwem sygnalizacji estrogenowej w gonadzie męskiej. Poprzez kontrolę komórek Leydiga i telocytów ERR i GPER regulują produkcję hormonów płciowych, co wpływa na spermatogenezę. Receptory te mogą być jednocześnie dodatkowymi markerami stanów patologicznych tkanki interstycjalnej jądra, szczególnie tych związanych ze zmianami produkcji i stężenia estrogenów. Badania finansowane przez Narodowe Centrum Nauki, granty SONATA BIS5 2015/18/E/NZ4/00519 i OPUS12 2016/23/B/ NZ4/01788.

NIEKODUJĄCE RNA PLAZMY NASIENNEJ JAKO DIAGNOSTYCZNY I PROGNOSTYCZNY BIOMARKER NIEPŁODNOŚCI MĘSKIEJ

Małgorzata Kotwicka, Weronika Tomaszewska

Katedra i Zakład Biologii Komórki, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu e-mail: mkotwic@ump.edu.pl

U około 60–75% mężczyzn diagnozowanych z powodu niepłodności nie udaje się ustalić wyraźnego czynnika przyczynowego co sprawia, że stwierdza się u nich niepłodność idiopatyczną. Poszukiwania nowych biomarkerów, które będą wykazywały wysoką specyficzność i czułość w stosunku do niepłodności męskiej oraz dostarczą dodatkowych informacji na temat molekularnych mechanizmów leżący u podstaw tej patologii są więc uzasadnione. Ponieważ nasienie jest materiałem biologicznym stosunkowo łatwym do pozyskania, w sposób naturalny staje się obiektem tych badań. W wielu płynach ustrojowych, takich jak osocze, surowica, ślina, łzy, płyn mózgowo-rdzeniowy, popłuczyny drzewa oskrzelowego, mleko czy mocz obecne są cząsteczki wolnych od komórek, niekodujących RNA (ncRNA, ang. non-coding RNA). Ze względu na wielkość cząsteczki wyróżniono trzy główne klasy ncRNA: krótkie niekodujące RNA (sncRNA, ang. small non-coding RNA), długie niekodujące RNA (lncRNA, ang. long non-coding RNA) i bardzo długie niekodujące RNA (vlncRNA, ang. very long ncRNA). Niekodujące RNA nie ulegają translacji do białek, mogą jednak modulować komórkowe matrycowe RNA (mRNA, ang. messenger RNA) i poziomy białek powodując degradację mRNA lub hamowanie translacji. Ze względu na mechanizm ich powstawania i współpracującego z nimi białka sncRNA zostały podzielone na trzy główne klasy: mikroRNA (miRNA, ang. micro RNA), małe interferencyjne RNA (siRNA, ang. small interfering RNA) oraz RNA oddziałujące z białkami PIWI (piRNA, ang. piwi-interacting RNA). Przyjmuje się, że zewnątrzkomórkowe sncRNA mogą odzwierciedlać zmiany molekularne zachodzące w komórkach, z których pochodzą. Oznacza to, że profilowanie ich ekspresji mogło by się stać dobrym narzędziem diagnostycznym i prognostycznym. Znaczna liczba cząsteczek ncRNA zaangażowana w poszczególne procesy komórkowe sprawia jednak, że badania te są nie łatwe i bardzo rozległe. W plazmie nasiennej wykazano obecność wolnych od komórek zarówno miRNA jak i piRNA. Należy jednak pamiętać, że miRNA mogą być wydzielane przez wielu typów komórek i tkanek, a plazmę nasienia tworzy wydzielina, na którą składają się produkty jąder, najądrzy, pęcherzyków nasiennych, gruczołów opuszkowo-cewkowych czy gruczołu krokowego. Zatem miRNA plazmy nasienia mogą nie dostarczać w jednoznaczny sposób informacji o rodzaju i miejscu patologii. Mimo tego zmiana we wzorcach ekspresji miRNA (np. miR-34b/c, miR 334a/b/c, miR-449a, miR-19a, miR-31-5p, miR- -539-5p i miR-941) została powiązana z różnymi histopatologicznymi obrazami ludzkich jąder (np. zespołem samych komórek Sertolego, zatrzymaniem dojrzewania komórek spermatogenezy) czy nasieniem z cechami astenozoospermii, oligozoospermii, oligoastenozoospermii i azoospermii (Abu-Halima i wsp.: Fertil Steril. 2013, 99, 1249–1255; Barcelo i wsp.: Hum Reprod. 2018,33, 1087– 1098; Hu i wsp.: Clin Biochem. 2014, 47, 967–72; Tian wsp.: Forensic Sci Int Genet. 2018, 33, 161–167). Z kolei piRNA wykazują szczególnie wysoką ekspresję w spermatocytach pachytenu i okrągłych spermatydach. Wydają się odgrywać bezpośrednią rolę w spermatogenezie, na co wskazują badania, w których wyciszenie ekspresji białek PIWI, powodowało zahamowanie powstawania i dojrzewania plemników. Wśród obecnych w plazmie nasiennej piRNA, których ekspresja wiązana jest z obniżoną wartością biologiczną nasienia, wymienia się między innymi piR-31068, piR-31925, piR-43771, piR-43773 i piR-30198 (Hong i wsp.: Scientific Reports. 2016, 6: 224–229). W najnowszych badaniach wskazuje się również na długie niekodujących RNA oraz krążące DNA (cfs-DNA, ang. cell-free seminal DNA) jako na potencjalny marker w diagnostyce niepłodności. Analiza dostępnego piśmiennictwa wskazuje, że ncRNA stanowią obiecujące uzupełnienie dla tradycyjnych biomarkerów niepłodności męskiej.

WPŁYW ZAKAŻEŃ WIRUSEM SARS-COV-2 (COVID-19) NA ZDROWIE REPRODUKCYJNE MĘŻCZYZNY

Maciej Kurpisz, Monika Frączek

Instytut Genetyki Człowieka Polskiej Akademii Nauk, Poznań e-mail: maciej.kurpisz@igcz.poznan.pl

Koronawirus ciężkiego ostrego zespołu oddechowego 2 (SARS-Cov-2, ang. severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) jest rozpowszechnionym pandemicznie wirusem mającym niekorzystne oddziaływanie na funkcjonowanie wielu narządów, w tym i męskiego układu rozrodczego. Jego powszechność oddziaływania wiąże się z dużą liczba receptorów, za pośrednictwem których wnika on do układu gospodarza-żywiciela. Jednym z nich jest enzym konwertujący angiotensynę, ACE-2 (ang. angiotensin-converting enzyme 2), obecny na wszystkich komórkach gonady męskiej. Innym enzymem, ulegającym ekspresji na komórkach spermatogonialnych jest transbłonowy enzym proteazy serynowej (TMPRSS2, ang. transmembrane serine protease 2 enzyme), który rozszczepia kapsyd S wirusa SARS-Cov-2. Innymi asystującymi we wnikaniu wirusa receptorami są: BSG (ang. basigin), który jest induktorem metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej, obecny na oolemmie i trofektodermie (przez co przeszkadza w procesie wczesnego rozwoju zarodkowego), aminopeptydaza alanylowa (ANPEP, ang. alanyl aminopeptidase N) ulegająca nadekspresji w chorobie Parkinsona, jak również poprzez mechanizmy epigenetyczne powodująca kancerogenezę w obrębie gruczołu krokowego (jest także obecna w endometrium). Z kolei receptor, peptydaza dipeptydylowa-4 (DPP4/CD26, ang. dipeptidyl peptidase-4) ulega ekspresji na komórkach epitelialnych i endotelialnych, przez co może powodować zmiany w naczyniach licznych narządów, tj. płuc, nerek, jelita czy serca i powodować tzw. sztorm cytokinowy i/lub pobudzenie procesów zatorowo-zakrzepowych. Oddziaływanie wirusa SARS-Cov-2 poprzez receptor ACE-2 prowadzi do zaburzeń w funkcjonowaniu osi podwzgórze-przysadka-gonada męska, w pierwszej mierze poprzez dysfunkcję (spowodowaną wirusem) komórek Sertolego, wtórnie zakłócając spermatogenezę. Zatem wirus SARS-Cov-2 zwykle nie wywołuje zapalenia jądra na tle autoimmunologicznym, ale powoduje dysregulację endokrynowa, zapalną i immunologiczną na terenie gonady męskiej – przekształcające się w zjawiska wtórne wobec indukowanej nadprodukcji rodników tlenowych i towarzyszącej zwykle takiej nadprodukcji reakcji zapalnej. Wtórne zespoły naruszające integralność męskiego układu rozrodczego spowodowane są bardziej procesem terapeutycznym niż obecnością wirusa per se. Prym w tym dzierżą niespecyficzne leki antywirusowe, sterydy lub mało specyficzne przeciwciała poliklonalne (możliwość reakcji krzyżowych). Według powszechnie znanych mechanizmów leki antywirusowe uszkadzają komórki aktywnie dzielące się, przez co można wnosić, że mają faktyczny potencjał do uszkadzania spermatogenezy, podobnie jak glikokortykosteroidy, które dodatkowo uszkadzają połączenia ścisłe naruszając barierę krew-jądro, jak i samą spermatogenezę. Przykładowo, Ribavirin zawierający rybawirynę, obniża dodatkowo stężenie testosteronu. Naciekające do gonady męskiej leukocyty (w wyniku stanu zapalnego wywołanego wirusem SARS-Cov-2) produkują cytokiny i wolne rodniki tlenowe oraz nasilają produkcję cytokin, ulegających syntezie w samej gonadzie, przez co stworzone zostają warunki do lokalnego sztormu cytokinowego. Wskutek tych wszystkich wydarzeń może dojść do przejściowego obniżenia parametrów nasienia, które należy wówczas skrupulatnie monitorować w kierunku wskaźników stresu oksydacyjnego, odpowiednio poszukując algorytmów leczniczych z użyciem antyoksydantów. Można rozważyć suplementację testosteronu i przede wszystkim nakazać kilkumiesięczną karencję w staraniu się o potomstwo, o ile wdrożona została kuracja lekami antywirusowymi (zjawiska epigenetyczne, uszkodzenie plemnikowego DNA). Niepłodność głównie może być zaindukowana dysfunkcją komórek Sertolego, natomiast realnym problemem mogą się stać asymptomatyczne infekcje u dzieci przed pokwitaniem i długoterminowe efekty spowodowane nosicielstwem wirusa SARS-Cov-2 w immunologicznie uprzywilejowanym narządzie.

FRAGMENTACJA DNA PLEMNIKÓW – DIAGNOSTYKA I POSTĘPOWANIE

Krzysztof Łukaszuk1,2

1INVICTA Klinika Leczenia Niepłodności, Gdańsk, Warszawa, Wrocław, Bydgoszcz; 2Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Nauk o Zdrowiu, Zakład Pielęgniarstwa Położniczo-Ginekologicznego, Gdańsk e-mail: krzysztof.lukaszuk@invicta.pl

W skali światowej około 140 mln osób (13–15% par) nie uzyskuje ciąży po roku starań. Z nich tylko niewielka część podejmuje się leczenia. Czynnik męski to najbardziej niepoznany aspekt diagnostyki przyczyn niepłodności. Dotychczas brakuje jasno określonych wartości granicznych dla identyfikacji potencjału rozrodczego plemników na podstawie standardowych analiz nasienia. Wartość stworzonych przez Światową Organizacją Zdrowia (WHO, ang. World Health Organization) norm analizy nasienia wciąż jest kwestionowana. Najczęstsze odchylenia od normy badania – liczebność plemników, ich ruchliwość oraz prawidłowość morfologii plemników nie wytrzymują szczegółowej analizy ich związku przyczynowego z uzyskaniem ciąży. W świetle obecnych badań nawet trudno określić czy standardowe analizy nasienia zawierają parametry mające jednoznaczny związek z przyczyną niepłodności. Stąd poszukiwanie analiz ułatwiających diagnostykę i postępowanie z parą niepłodną. Wśród nich najbardziej przekonywającą jest analiza fragmentacji DNA plemników oraz inne nieprawidłowości związane z materiałem genetycznym zawartym w plemniku. Prawidłowo przebudowana chromatyny (zamiana histonów na protaminy) w jądrze dojrzałych plemników pełni funkcję ochronną DNA. Integralność chromatyny plemników jest niezbędna do prawidłowych funkcji rozrodczych. Jej zaburzenia powodują: niepłodność, gorszą jakość zarodka, niższy wskaźnik implantacji oraz zwiększone ryzyko poronienia i zwiększone ryzyko urodzenia chorego dziecka. Komórka jajowa może skutecznie naprawiać uszkodzenia chromatyny plemników w pewnym zakresie, jednak skuteczność mechanizmów naprawczych w komórkach jajowych zmniejsza się z wiekiem kobiety. Poznane dotychczas mechanizmy uszkodzeń DNA plemników to apoptoza lub anomalie powstałe podczas procesu spermatogenezy, pęknięcia nici DNA podczas przebudowy chromatyny w procesie spermiogenezy, pozajądrowe uszkodzenia DNA głównie przez wolne rodniki tlenowe podczas transportu przez kanaliki nasienne i w najądrzach, fragmentacja DNA indukowana przez endogenne kaspazy i endonukleazy, uszkadzający wpływ radio- i chemioterapii oraz toksyn środowiskowych. Za główny z nich uważa się stres oksydacyjny. Może on być związany z czynnikami wewnętrznymi (jak na przykład niedobór protaminy i wady upakowania DNA) co może dotyczyć nawet 15 % niepłodnych mężczyzn. Powinniśmy brać pod uwagę również czynniki zewnętrzne – stany zapalne narządów płciowych, ciepło, promieniowanie, chemioterapia, palenia papierosów. Palenie generuje wysokie poziomy stresu oksydacyjnego i zmniejsza stężenie antyoksydantów w osoczu nasienia. Fragmentacja DNA plemników nie koreluje niestety z podstawowymi parametrami nasienia. Podwyższony poziom uszkodzeń DNA plemników obserwowano u około 5% niepłodnych mężczyzn z prawidłowymi parametrami nasienia w porównaniu z 25% w grupie pacjentów z nieprawidłowymi parametrami nasienia. Podwyższony indeks fragmentacji DNA plemników wskazuje na zmniejszoną płodność męską niezależnie od ilości, ruchliwości i morfologii plemników. Wyniki oceny struktury chromatyny plemnikowej (test SCSA, ang. sperm chromatin structure assay), pozwalały na najlepszą ocenę szans na pomyślny przebieg ciąży w przypadku planowania pierwszej ciąży, również u par poddawanych inseminacji wewnątrzmacicznej (IUI, ang. intrauterine insemination). Dlatego tak ważnym jest używanie diagnostyki fragmentacji DNA plemników w algorytmie postępowania z parą niepłodną. Żeby móc skutecznie diagnozować przyczynę niepłodności należy posiadać odpowiednie narzędzie diagnostyczne. Obecnie mamy przynajmniej kilka metod oznaczania uszkodzeń DNA plemników. Jednak chęć upowszechnienia badania wraz z komercjalizacją testu wprowadziła na rynek również badania niewiarygodne lecz proste w wykonaniu i tanie w zakupie. Powoduje to, że grupa klinik pobiera od nieświadomych tego pacjentów opłaty porównywalne z wiarygodnymi testami za testy niewiarygodne uzyskując 1000% marże z badania. Wśród badań o potwierdzonej wiarygodności i jakości należy wymienić SCSA, TUNEL (ang. TdTmediated dUTP nick-end labelling) oraz test kometowy (ang. comet assay). Wśród testów o niepotwierdzonej przez niezależne badania należy wymienić hit komercyjny – test dyspersji plemnikowej chromatyny (SCD, ang. sperm chromatin dispersion) fałszywie nazywanym testem fragmentacji DNA plemników. Dotychczas nie zostało jednoznacznie ustalone miejsce fragmentacji DNA plemników w algorytmie postępowania – czy we wstępnej diagnostyce, diagnostyce poszerzonej, przed zapłodnieniem pozaustrojowych, czy może po jego niepowodzeniu. Ponieważ obecnie posiadamy narzędzie do, przynajmniej częściowej, separacji plemników z wysoką fragmentacją DNA, powstaje pytanie, czy nie powinniśmy również stosować tych oznaczeń po przeprowadzeniu selekcji plemników do zapłodnienia pozaustrojowego.

ŁYSIENIE ANDROGENOWE A ZDROWIE MĘŻCZYZNY

Mariola Marchlewicz1, Ewa Duchnik2

Katedra i Klinika Chorób Skórnych i Wenerycznych, 2Zakład Dermatologii Estetycznej, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie e-mail: mariola.marchlewicz@pum.edu.pl

Obecność zdrowych, prawidłowo rosnących włosów jest bardzo ważna dla dobrego samopoczucia mężczyzn. Procesy wzrostu i wymiany włosów podlegają regulacji m.in. przez androgeny. W niektórych miejscach androgeny nie wywierają żadnego wpływu, w innych pobudzają lub hamują wzrost włosów. U mężczyzn, wysokie stężenie androgenów, stymuluje wzrost włosów na twarzy, w okolicy nadłonowej i na klatce piersiowej. Natomiast w obrębie skóry głowy androgeny mogą wywoływać łysienie. Mieszki włosowe są wrażliwe na androgeny dzięki ekspresji receptorów androgenowych (AR, ang. androgen receptor) w komórkach brodawki włosa (DPC, ang. dermal papilla cells). Ekspresja AR jest znacznie wyższa w DPC brody oraz okolic podlegających łysieniu androgenowemu, niż w komórkach niełysiejącej skóry okolicy potylicznej. Łysienie androgenowe (AGA, ang. andro genetic alopecia) dotyczy ok. 50% dorosłych mężczyzn poniżej 50. r.ż. i ponad 70% powyżej 70. r.ż. Obraz kliniczny polega na utracie włosów początkowo w okolicy czołowej, a następnie w obrębie szczytu głowy. Nasilenie choroby ocenia się w skali Hamiltona-Norwooda. Podstawowym procesem patogenetycznym w AGA jest, mediowana przez dihydrotestosteron (DHT, ang. dihydrotestosterone), miniaturyzacja mieszków włosowych, w okolicach androgenozależnych. Istotne znaczenie w patogenezie AGA mają czynniki genetyczne (polimorfizm pojedynczego nukleotydu w eksonie 1 genu AR zlokalizowanego na długim ramieniu chromosomu X), hormonalne (testosteron, DHT) i środowiskowe. Uważa się, że w AGA dochodzi, w obrębie mieszka włosowego, do zmiany interakcji między DPC a keratynocytami. Kompleks androgeny/AR ma wpływ na syntezę w DPC czynników, które regulują zarówno funkcję tych komórek autokrynnie, jak i funkcję komórek nabłonkowych mieszków na drodze parakrynowej np. poprzez insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1, ang. insulin-like growth factor 1), w obrębie komórek brodawek skórnych, w okolicach skóry objętej procesem łysienia, poziom wydzielania tej cytokiny jest aż 6 razy niższe niż w skórze nie objętej łysieniem, co potwierdza istotną rolę IGF-1 w hamowaniu procesu łysienia i może stać się podłożem do stworzenia nowych opcji terapeutycznych tego schorzenia. Androgeny wpływają też na zmianę transkrypcji genów w DPC regulujących cykl wzrostu włosów. Odpowiadają za zmniejszenie liczby komórek w mieszku włosa, gdyż wysokie poziomy testosteronu i DHT indukują apoptozę DPC oraz utratę ich właściwości proliferacyjnych. W konsekwencji następuje skrócenie fazy anagenu i zmniejszenie wielkości mieszków. Zmienia się aktywność DPC, keratynocytów oraz melanocytów, co prowadzi do przekształcenia mieszków włosów ostatecznych do meszkowych i tworzenia włosów krótszych, cieńszych i odbarwionych (Marchlewicz i wsp.: Post Androl Online. 2014, 1(2), 14–24). Poza negatywnym wpływem AGA na jakość życia coraz więcej badań wskazuje na jego związek ze zwiększonym ryzykiem sercowo-naczyniowym. U osób z AGA częściej stwierdza się zespół metaboliczny, otyłość, nadciśnienie tętnicze, dyslipidemię, insulinooporność i przyspieszony rozwój miażdżycy. Kryteria rozpoznania zespołu metabolicznego spełnia 20–57% pacjentów z AGA. Patomechanizm współwystępowania łysienia androgenowego i chorób sercowo-naczyniowych jest złożony i obejmuje czynniki genetyczne (zwiększona wrażliwość na androgeny i zwiększona aktywność 5α-reduktazy), hormonalne (zwiększone stężenie insuliny, aldosteronu, leptyny) oraz zapalne (cytokiny, reaktywne formy tlenu). U pacjentów z AGA wokół mieszków włosowych stwierdza się odczyn zapalny, a w surowicy pacjentów z AGA o wczesnym początku stwierdzono zwiększone stężenia markerów stresu oksydacyjnego. Metaanaliza danych literaturowych wykazuje związek AGA ze zwiększonymi poziomami cholesterolu i trójglicerydów w surowicy krwi oraz wyższymi wartościami ciśnienia skurczowego i rozkurczowego krwi u tych mężczyzn (Wernicka i wsp.: Przegl Dermatol. 2018, 105, 716–725).

PROGNOSTYCZNE ZNACZENIE TESTÓW CZYNNOŚCIOWYCH W ROZRODZIE

Katarzyna Marchlewska

Katedra Andrologii i Endokrynologii Płodności, Uniwersytet Medyczny w Łodzi e-mail: katarzyna.marchlewska@umed.lodz.pl

W ostatnich latach wiele uwagi poświęca się badaniom dotyczącym jakości plemników. Obserwuje się znaczący postęp wiedzy na temat znaczenia integralności chromatyny plemnikowej, szczególnie fragmentacji DNA czy prawidłowej protaminacji. Szczególna uwaga zwrócona jest na ocenę stresu oksydacyjnego i konsekwencje tego zjawiska. Jednak nie mniej ważnym zagadnieniem wydaje się ocena czynności plemników.Podstawowym parametrem opisującym czynność plemników w badaniu ogólnym nasienia jest ruchliwość. Często dla celów prognostycznych oblicza się również wskaźnik określany jako całkowita liczba ruchliwych plemników (TMSC, ang. total motile sperm count), wartości referencyjne dla tego parametru są wciąż tematem dyskusji. Część autorów przyjmuje wartość prawidłową powyżej 10 mln, a część powyżej 5 mln, ale są prace wskazujące, że wartość minimalna powinna wynosić 1 mln. Wskaźnik ten wykorzystuje się zwykle przy kwalifikowaniu pary do inseminacji domacicznej (IUI, ang. intrauterine insemination), ale również przy ocenie szans na naturalne zapłodnienie. Wiele badań wskazuje, że sama zdolność do ruchu nie zapewnia plemnikowi udziału w procesie rozrodu. W naturalnych warunkach około 1% plemników zdeponowanych podczas stosunku płciowego przenika do macicy, a liczba ta jest stale redukowana wraz z pokonywaniem przez nie kolejnych odcinków żeńskiego układu płciowego. Dlatego tak istotnym parametrem jest ocena ich zdolności do migracji. Proces ten wiąże się ze zdolnością męskich gamet do hiperaktywacji, chemo- i termotaksji. Zdolność plemników do migracji ocenia się przy użyciu czynnościowego testu, jakim jest test migracyjny (ang. swim up). Wynik testu wskazuje na liczbę plemników, które migrują w ciągu 1 godziny z 1 mL natywnej próbki nasienia do 1,2 mL medium o składzie przypominającym płyn jajowodowy, i wyrażony jest jako koncentracja ruchliwych plemników (mln/mL) po preparatyce. Test wykorzystuje się przy ocenie szans na naturalne zapłodnienie, IUI oraz klasyczne zapłodnienie pozaustrojowe (IVF, ang. in vitro fertilization). Test nie ma wartości odcięcia, ponieważ przy interpretacji należy pamiętać, że wynik testu nie uwzględnia całej objętości ejakulatu i tę należy przy ocenie testu uwzględnić indywidualnie. Jeśli ocenimy skuteczność zapłodnienia metodą IUI w zależności od liczby ruchliwych plemników, które zostaną podane do macicy w literaturze wartość graniczna dla tego parametru waha się od 0,8 nawet do 20 mln plemników. Choć na uwagę zasługuje stanowisko American Society for Reproductive Medicine (ASRM), gdzie wykazano, że skuteczność inseminacji rośnie wraz z liczbą plemników transferowanych do macicy, ale tylko do 9 mln, a potem utrzymuje się na stałym poziomie. Jeśli natomiast rozważana jest kwalifikacja do procedury IVF, optymalne warunki daje wynik 70–100 tysięcy plemników na każdy oocyt. Zapłodnienie jest wieloetapowym i skomplikowanym procesem i nie opracowano jeszcze diagnostycznych metod, które na każdym etapie sprawdzałyby czynność męskich gamet, ale dostępny jest test, który wskazuje na dojrzałość plemników i ocenia ich zdolność do wiązania z kwasem hialuronowym (HBA, ang. hyaluronan binding assay). Fizjologicznie kwas hialuronowy znajduje się w wieńcu promienistym oocytu i jest rozpraszany dzięki hialuronidazie zlokalizowanej na główkach plemników. Zgodnie z zaleceniami producenta testu wartość ≥80% ruchliwych plemników reagujących w teście uznano za prawidłową. Jednak badania sugerują, że wartość HBA <60% znacząco wskazuje na obniżoną dojrzałość plemników (Huszar i wsp., Reprod Biomed, 2007, 14, 650–663), podczas gdy pacjenci z wynikiem wiązania ≤65% mają zmniejszoną szansę na posiadanie dojrzałego plemnika losowo wybranego do ICSI (Worrilow i wsp., Hum Reprod, 2013, 28, 306–314). Na przykładzie badań własnych przedstawiona zostanie częstość występowania zaburzeń związanych z czynnością męskich gamet w populacji mężczyzn zgłaszających się na badanie nasienia w aglomeracji łódzkiej.

HORMON FOLIKULOTROPOWY (FSH) REGULUJE SYGNALIZACJĘ NOTCH W JĄDRZE SZCZURA W OKRESIE DOJRZEWANIA PŁCIOWEGO

Katarzyna Marchlewska

Sylwia Marek1, Alicja Kamińska1, Małgorzata Brzoskwinia1, Laura Pardyak2, Anna Hejmej1, Barbara Bilińska1

1Zakład Endokrynologii, Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych, Wydział Biologii, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie, 2Ośrodek Medycyny Eksperymentalnej i Innowacyjnej, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie; e-mail: s.marek@doctoral.uj.edu.pl

Funkcja gonady męskiej ssaków jest utrzymywana przez oś podwzgórzowo-przysadkową, której aktywacja w okresie dojrzewania płciowego związana jest z pulsacyjnym wydzielaniem gonadoliberyny (GnRH, ang. gonadotropin-releasing hormone) z podwzgórza. Hormon folikulotropowy (FSH, ang. follicle-stimulating hormone), uwalniany w odpowiedzi na ten sygnał, bierze wraz z androgenami udział w kontroli spermatogenezy. Badania z wykorzystaniem gryzoni dowiodły, że FSH, regulując funkcje komórek Sertolego, ogranicza apoptozę komórek płciowych podczas pierwszej fali spermatogenezy, a także wpływa na proliferację i różnicowanie spermatogoniów (O’Shaughnessy: Semin Cell Dev Biol. 2014, 29, 55–65). Komórki Sertolego kontrolują spermatogenezę poprzez wzajemne interakcje oraz komunikację z komórkami płciowymi. Jednym z typów bezpośrednich oddziaływań międzykomórkowych w nabłonku plemnikotwórczym jest komunikacja z udziałem szlaku sygnałowego Notch (Murta i wsp.: PLoS One. 2013, 8, e72767). Chociaż rola sygnalizacji Notch w przebiegu spermatogenezy jest w ostatnich latach przedmiotem intensywnych badań, regulacja funkcjonowania tego szlaku w nabłonku plemnikotwórczym jest wciąż słabo poznana. Badania autorskie z wykorzystaniem szczurów poddanych działaniu antagonisty GnRH, a następnie suplementacji FSH, wskazują, że funkcjonowanie szlaku Notch w jądrach w okresie dojrzewania płciowego podlega działaniu FSH. Przeprowadzone analizy wykazały zmiany w ekspresji receptorów Notch1, Notch2 oraz Notch3, a także aktywnych form tych receptorów w nabłonku plemnikotwórczym, zarówno w komórkach Sertolego, jak i w komórkach płciowych szczurów po ekspozycji na FSH. Ocenie poddano także ekspresję genów efektorowe Hes1 i Hey1 kontrolowanych przez szlak Notch, a lokalizację białek HES1 i HEY1 w kanaliku plemnikotwórczym potwierdzono za pomocą analizy immunohistochemicznej. Po podaniu FSH stwierdzono spadek ekspresji Hes1, co może świadczyć o ograniczeniu aktywności tego szlaku w nabłonku plemnikotwórczym. Uzyskane wyniki wskazują, że FSH reguluje bezpośrednią, opartą na szlaku Notch, komunikację pomiędzy komórkami nabłonka plemnikotwórczego. Wzajemne oddziaływania między FSH i szlakiem Notch mogą stanowić molekularny mechanizm odpowiedzialny za wpływ FSH na zdolność komórek Sertoliego do wspierania rozwoju komórek rozrodczych. Obserwacje te mogą przyczynić się do wyjaśnienia podłoża zaburzeń rozwoju komórek płciowych związanych z zakłóconym działaniem FSH. Badania finansowane przez Narodowe Centrum Nauki, grant OPUS13 2017/25/B/NZ4/01037